多聚甲醛配制(复方多聚甲醛粉使用方法)

肿瘤高分文章必：细胞免疫荧光详细方案分享！

在细胞免疫荧光过程中，需要使用细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。,细胞玻片。通过将载玻片浸泡在细胞培养基中，细胞在载玻片上生长，然后进行细胞免疫荧光。

实验前准备：

1.胰液素

2.DMEM细胞培养基

3.细胞培养12孔板或6孔板

爬上电影

实验步骤：

1细胞种板与细胞爬片制备：

1)当细胞密度约为90%-95%时，用预热的胰酶消化细胞，将细胞重悬于完整的培养基中，充分吹气使其成为单细胞悬液，计数。

2)取12孔板进行细胞培养，根据爬片的大小，在每个孔中放置爬片的位置滴几滴培养基，然后将爬片放在滴板上并压紧，使爬片和培养皿通过培养基的张力结合在一起，防止爬片在加入细胞悬液时上浮，形成双层细胞贴片。根据您自己的需要选择合适的细胞密度，并将其种植在12孔板中。

3)3)24h或48h后，根据细胞生长速度观察判断细胞密度，90%左右进行细胞免疫荧光。

2细胞的固定及免疫荧光

1)吸收培养基，一般加入PBS浸泡细胞3次，每次5 min。

2)向孔中加入1毫升4%多聚甲醛，在室温下固定细胞20分钟。

3)吸收多聚甲醛，在PBS中浸泡3次，每次5 min。

4)在室温下，将0.5%Triton X-100(PBS)加入孔中20分钟，以使细胞可渗透。

5)取出Triton X-100，在PBS中浸泡3次，每次5 min。

6)用10%山羊血清(PBS)或5%牛血清白蛋白封闭2小时(选择的封闭液与后续操作中的抗体稀释液一致)。密封后不需要用PBS清洗。

7)吸掉封闭液，向每个孔中滴入足够的适当浓度的一级抗体(抗体浓度可根据第一次抗体说明书推荐，后续实验可找到适当的抗体浓度)，在4的湿箱中孵育过夜。

8)吸收一级抗体，在PBS中浸泡3次，每次5 min。

9)向孔中滴入足够的适当浓度的二抗，并在室温下黑暗中于37孵育1小时。注意，二抗是荧光素标记的，所以操作过程尽量在暗处进行。

10)吸掉二级抗体，在PBS中浸泡3次，每次5 min。

11)将DAPI滴在载玻片上，或Hoechst复染细胞核，其通常为蓝色荧光；黑暗中孵育5-10分钟。

12)用PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以洗掉过量的DAPI。

13)取爬片时，由于爬片与培养皿底部结合紧密，张力大，可以使注射器针头针尖变尖

在背面做一个小挂钩，这样就可以轻轻地把攀爬片勾起来，用小镊子把它取出来。

14)用吸水纸吸收爬片上的液体，用含有抗荧光淬灭剂的密封液密封爬片，注意将爬片反贴在聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察采集图像，注意选择与抗体对应的激发光源。

注意事项：

(1)取细胞爬片时，动作要轻柔，防止细胞爬片被压碎，影响实验过程。

(2)在种植细胞的过程中，要注意将细胞轻轻混合，以“八”或“十”字形摇动，防止细胞局部生长过密。

(3)稀释、添加二抗(荧光抗体)和随后的洗涤应避光。

(4)免疫荧光细胞玻片后，要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。或者放在卡带里，暂时存放在4度冰箱里，尽快拍照。

(5)用荧光显微镜拍照时，根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI可以将凋亡和非凋亡细胞染成红色/蓝色，只有在凋亡细胞核中才能掺入FITC-12-dUTP定位绿色荧光