红斑马鱼(斑马鱼雌雄鉴别图片)

杜九林的研究小组建立了双色标记条件基因敲除斑马鱼的新方法

斑马鱼是研究发育和疾病的重要模式动物。其幼鱼体积小、透明、组织结构简单、复杂，便于研究组织器官发育的动态过程和各种生理活动。为了充分发挥斑马鱼在研究中的优势，建立斑马鱼的遗传操作方法非常重要。目前，在斑马鱼中，产生全基因功能缺失的方法已经成熟并被广泛应用。然而，在特定组织和细胞类型中特异地敲除基因的技术还很不成熟，这也是目前制约斑马鱼研究领域发展的瓶颈之一.

近日，中国科学院神经病学研究所杜久林课题组在Science China Life Sciences .发表了题为“One-step Generation of Zebrafish Carrying a Conditional Knockout-Knockin Visible Switch via CRISPR/Cas9-Mediated Intron Targeting”的研究论文，建立了一种新的斑马鱼组织特异性基因敲除技术，zCKOIS ,(ze布拉菲什、C翁丁国家、K诺克、O)UT-KnockIN . Sina.com/Switch) . Sina.com/通过在基因内含子中进行Cas9定点操作，利用非同源物的高效性，实现了可视化组织细胞特异性基因敲除

图1S

图a，利用CRISPR/Cas9系统构建内含子打靶介导的hey2 zCKOIS斑马鱼模型图。斑马鱼hey2基因有5个外显子，E4和E5分别代表第4和第5个外显子。sgRNA的靶序列为红色，原间隔基相邻基序(PAM)的序列为绿色。供体质粒的左右臂序列用带双箭头的棕色线表示。将供体质粒、sgRNA和zCas9 mRNA一起注射到斑马鱼胚胎中，hey 2 zCKOIS质粒可以定向整合到hey 2最后一个内含子的位点。图b是血管内皮细胞(ECs)中hey2特异性敲除的示意图。有纯的和hey 2 zco IOs；在zCKOIS和Ki(flk1-P2A-Cre)背景的斑马鱼中，内皮细胞中的Hey2蛋白被特异性破坏。在没有Cre表达的非ECs中，Hey2 zCKOIS不会被逆转，Hey2蛋白正常表达。图c，3.5天hey 2 zCoIs/zCoIs；Ki(flk 1-P2A-克雷)胚胎主干血管共焦投影图像(侧视图)。Ki(flk1-P2A-Cre)株在血管内皮细胞中表达Cre，反之开始在hey2 zCKOIS中表达TagRFP，而Hey2-EGFP在血管中的表达消失(用白色箭头表示)。脊髓胶质细胞表达的Hey2-EGFP不受影响(黄色箭头)。图d，没有Ki(flk1-P2A-Cre)背景，血管内皮细胞不表达Cre，hey2 zCKOIS不会逆转，没有红色荧光表达，Hey2-EGFP正常在血管中表达(白色箭头)。蓝色箭头和白色星号表示皮肤上的非特异性荧光信号。比例尺：100微米。

在本研究中，李佳博士及其同事将含有两对LoxP/LoxP5171序列(图1中的LoxP 5171/LoxP-tag RFP-LoxP 5171/LoxP序列)的元件巧妙地构建到含有正敲入序列(图1中的E5-EGFP序列)的供体质粒中，并通过非同源重组将其插入hey2基因的内含子中，建立hey2基因无Cre蛋白表达，hey2基因的结构和功能完整，hey2基因绿色荧光被敲入这时，，被用来敲入绿色荧光标签。而Cre蛋白表达启动后，两对LoxP位点的DNA序列元件被Cre逆转，逆转后的序列通过剪接受体与hey2基因的前一外显子(E4)结合，导致含有重要功能域的最后一个外显子(E5)缺失，破坏了基因的结构和功能，并在被破坏的基因上加了红色荧光标记。因此，结合特异性Cre表达，实现了构建 hey2 zCKOIS 斑马鱼品系并在血管内皮细胞特异性敲除hey2基因 对特异性基因的敲除。

利用这项技术，研究人员可以直接通过荧光显微镜下的彩色zCKOIS ，判断细胞中的基因是否被敲除，从而消除了通过杀死样本进行聚合酶链反应扩增和测序后鉴定其基因型的繁琐操作。zCKOIS ,看到,。

这项工作由李佳博士、博士生李宏宇、新华医院顾山野博士共同完成。云华星博士也有贡献。副研究员李佳、研究员杜九林为通讯作者。